Russian Federation
Russian Federation
Russian Federation
615.9
57.012.4
57.087.1
V stat'e otrazheny rezul'taty morfometricheskogo analiza deystviya razrabotannogo profilakticheskogo kompleksa v otnoshenii sohraneniya ul'trastruktury podocitov pochek krys i krolikov pri sochetannom mikotoksikoze. Cel' issledovaniya – opredelenie protektivnogo effekta razrabotannogo profilakticheskogo kompleksa, v sostav kotorogo vhodit prirodnyy mineral galluaziat (ranee ne primenyavshiysya v RF pri mikotoksikozah), na ul'trastrukturu podocitov krys i krolikov v usloviyah podostroy intoksikacii mikotoksinami (T-2, aflatoksinom V1, zearalenonom). Eksperiment prohodil v techenie 21 sutok na 40 belyh nelineynyh krysah zhivoy massoy 150–170 g i 40 krolikah porody shinshilla zhivoy massoy 1,7–1,9 kg. Iz zhivotnyh kazhdogo vida po principu analogov sformirovali 4 gruppy po 10 golov v kazhdoy (biologicheskiy kontrol', toksicheskiy kontrol', osnovnoy racion s profilakticheskim kompleksom, toksicheskiy racion s profilakticheskim kompleksom) s uchetom vozrasta, pola i massy tela. Proby tkani pochek issledovali na prosvechivayuschem elektronnom mikroskope po metodike ul'tratonkih srezov. V rezul'tate statisticheskogo analiza poluchennyh v provedennom eksperimente morfometricheskih dannyh byli vyyavleny otlichiya shiriny citopodiy mezhdu profilaktiruemoy gruppoy i gruppoy biologicheskogo kontrolya – s odnoy storony, i gruppoy toksicheskogo kontrolya – s drugoy. Vsledstvie etogo bylo sdelano zaklyuchenie, chto razrabotannyy profilakticheskiy kompleks obladaet effektivnost'yu pri peroral'nom primenenii v usloviyah sochetannogo T-2, afla-, zearalenonmikotoksikoza laboratornyh zhivotnyh (krys i krolikov), ne okazyvaya pri etom negativnogo vliyaniya na ul'trastrukturu pochek.
mycotoxins, podocytes, ultrastructure, morphometry, prophylactic agent
Введение. Метаболизм различных веществ, включая токсины, не может происходить без участия почек, роль которых в этом процессе в ряде случаев даже выше роли печени, что делает ее мишенью токсического воздействия [1]. Эта функция (как и ряд других, связанных с поддержанием базальной мембраны почечного клубочка, формированием щелевой мембраны и других) осуществляется в первую очередь благодаря подоцитам – специализированным клеткам клубочкового фильтрационного барьера [2–4]. Повреждение подоцитов может стать причиной развития протеинурии, отслоения их от базальной мембраны клубочка, нарушения целостности базальной мембраны и, возможно, почечной недостаточности [2, 4–8]. Подоцит формирует ветвящиеся структуры, наименьшие конечные отростки которых, цитоподии, образуют щелевые диафрагмы и являются главным функциональным элементом фильтрационного барьера [7]. Щелевые диафрагмы рассматриваются большинством исследователей как «молекулярное сито» – конечная преграда для потери белка с мочой [3, 4, 7–9]; однако есть указания на то, что их функция является чисто структурной [9]. Среди современных средств визуализации многообразных патологических изменений подоцитов классическая просвечивающая электронная микроскопия не теряет своей актуальности [9, 10]. Степень повреждения подоцитов является основным маркером при оценке функционального состояния почек [3, 5, 6]. При микроскопировании ультраструктуры подоцитов внимание обращают на такие патологические признаки, как расширение, втягивание или стирание цитоподий; отслоение от базальной мембраны; утолщение самой базальной мембраны, в том числе неравномерное; микроцистозные и псевдокистозные изменения, вакуолизация, обогащение цитоплазмы лизосомами; нарушение щелевых диафрагм [2, 8, 10]. Микотоксины – это одна из наиболее значительных угроз в сфере производства и реализации сельскохозяйственной продукции, оказывающей влияние на безопасность кормов, здоровье и продуктивность животных, а также на здоровье человека путем миграции по пищевым цепям [11–15]. В целях предотвращения пагубного воздействия микотоксинов разработан ряд стратегий борьбы, в основном профилактической направленности. Среди них особое место занимают исследования по созданию эффективных препаратов комплексного действия, которые способны подавлять или уменьшать абсорбцию, стимулировать выведение микотоксинов или изменять механизм их действия [16]. В целом механизмы молекулярных эффектов, особенно при смешанных микотоксикозах, изучены недостаточно. В литературе отсутствуют данные о влиянии зеараленона, афлатоксина В1 и Т-2 токсина при одновременном поступлении в высоких дозах на ультраструктуру почек. Цель исследования – определение протективного эффекта разработанного в ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» профилактического комплекса, в состав которого входит природный минерал галлуазиат (ранее не применявшийся в РФ при микотоксикозах), на ультраструктуру подоцитов крыс и кроликов в условиях подострой интоксикации микотоксинами (Т-2, афлатоксином В1, зеараленоном). Ранее нами была изучена ультраструктура гепатоцитов с морфометрическими характеристиками митохондрий при смешанном микотоксикозе белых крыс на фоне применения разработанного профилактического комплекса, подтверждена высокая адсорбционная активность галлуазита в отношении микотоксинов и показан протективный эффект на целостность ДНК [17–21]. Объекты, материал и методы. В соответствии с целью исследования из питомника были отобраны и помещены в условия двухнедельного карантина 40 белых нелинейных крыс живой массой 150–170 г и 40 кроликов породы шиншилла живой массой 1,7–1,9 кг. Животных содержали в одинаковых условиях кормления и ухода со свободным доступом к корму и воде. По истечении срока карантинирования из животных каждого вида по принципу аналогов сформировали 4 группы (по 10 голов в каждой) с учетом возраста, пола и массы тела. Схема опыта была следующей: – 1-я группа – биологический контроль (далее БК); – 2-я группа – профилактический комплекс на основе галлуазита, метионина, β-глюканов, шрота расторопши из расчета 0,25 % к основному рациону (далее БК+ПК); – 3-я группа – токсический контроль (далее ТК). Микотоксины животным задавали с кормом (белым крысам: афлатоксин В1 – 2,5 мг/кг, Т-2 токсин – 5 мг/кг и зеараленон – 2,0 мг/кг; кроликам – 0,3, 1,2, 1,7 мг/кг корма соответственно) путем тщательного перемешивания; – 4-я группа – профилактический комплекс на основе галлуазита, метионина, β-глюканов, шрота расторопши из расчета 0,25 % к токсическому рациону (далее ТК+ПК). Эксперимент проходил в течение 21 суток. После его завершения, согласно правилам гуманного отношения к лабораторным животным, особей всех групп выводили из опыта [22]. В последующем производили отбор проб корковой зоны почек (размером 1 мм3) для ультраструктурных исследований и помещали их в 1 % раствор глутарового альдегида. Далее, после промывки 0,1 М фосфатным буфером, кусочки органов переносили на 2 ч в 1 % раствор тет¬раоксида осмия для завершения фиксации. Затем проводили дегидратацию и заключение образцов в смесь эпоновых смол с последующей полимеризацией и подготовкой для исследования по методике ультратонких срезов [23, 24]. Полученные на ультрамикротоме срезы материала монтировали на медные сетки, контрастировали с помощью растворов уранилацетата и цитрата свинца. Просмотр и съемку образцов каждой группы осуществляли на электронном микроскопе Jeol JEM-1011 с последующей морфометрией в программе Fiji [25]. В ходе морфометрического анализа просматривали разрез дистального участка почечных клубочков и измеряли ширину цитоподий по линии щелевых диафрагм (рис. 1). Результаты подвергали статистической обработке в программе STATISTICA 6.0 с использованием непараметрического теста Манна – Уитни. Тестовые данные интерпретировали исходя из критического уровня значи¬мости α = 0,05, скорректированного по методу Бонферрони до α = 0,01 с учетом количества тестов (n = 5, табл. 1). Таблица 1 Дизайн и результаты статистической обработки экспериментальных данных Вид животного Группа БК+ПК ТК ТК+ПК Кролики БК 0,79 0,1•10-22 0,13 ТК 0,2•10-20 n 0,3•10-15 Крысы БК 0,75 0,5•10-4 0,07 ТК 0,3•10-7 n 0,3•10-2 Примечания: на пересечении строки и столбца указано точное значение p в тесте Маннна – Уитни для соответствующей пары групп; n – статистическое сравнение не проводилось. Рис. 1. Фрагмент почки: Н – ножка подоцита; Д – щелевая диафрагма; Ш – уровень, на котором измерялась ширина ножки подоцита Результаты и их обсуждение. Визуально группы контроля и опыта различались слабо, указанные в литературных источниках признаки цитопатологии, такие как втягивание или стирание цитоподий, отслоение подоцитов, не фиксировались (рис. 2, 3). Результаты морфометрического анализа приведены в таблице 2. Рис. 2. Фрагменты почек крыс разных групп: А – БК, Б – БК+ПК, В – ТК, Г – ТК+ПК Рис. 3. Фрагменты почек кроликов разных групп: А – БК, Б – БК+ПК, В – ТК, Г – ТК+ПК Таблица 2 Средняя ширина ножек подоцитов крыс и кроликов (M (Sd), μм) Группа Кролики Крысы БК 0,26 (0,17)a 0,31 (0,22)a БК+ПК 0,27 (0,2)a 0,32 (0,25)a ТК 0,46 (0,32)b 0,43 (0,32)b ТК+ПК 0,29 (0,21)a 0,39 (0,33)a Примечания: а – исследуемые группы статистически значимо отличались от группы, получавшей токсический рацион; b – группа, имеющая статистически значимые отличия от группы биологического контроля и группы, получавшей профилактический комплекс. Из данных, представленных в таблице 2, видно, что ширина ножек подоцитов группы ТК значимо (р < 0,01, табл. 1) отличалась от группы биологического контроля (происходит увеличение этого показателя). Это свидетельствует о существовании морфологического ответа со стороны цитоподий на воздействие микотоксинов и соответствует литературным данным [2, 3, 6, 13, 14, 16]. При этом такого эффекта не наблюдается в группе, получавшей профилактический комплекс в дополнение к основному рациону (что косвенно указывает на безвредность применяемого средства). Описанные закономерности наблюдались при исследовании почек крыс и кроликов. При статистическом сравнении группы, получавшей профилактический комплекс в дополнение к рациону, контаминированному микотоксинами, с группами биологического и токсического контроля были выявлены значимые отличия лишь от группы ТК (р<0,01), что также показано для животных обоих видов. Показатели ширины ножек подоцитов в группе, получавшей профилактический комплекс, не увеличивались по сравнению с контролем. Заключение. Статистический анализ морфометрических данных позволил выявить отличия ширины цитоподий между профилактируемой группой и группой биологического контроля – с одной стороны, и группой токсического контроля – с другой. На основании проведенного исследования можно заключить, что исследуемый профилактический комплекс оказывает защитный эффект в отношении ультраструктуры почек при пероральном применении в условиях сочетанного микотоксикоза лабораторных животных (крыс и кроликов).
1. Khan K.N.M., Hard G.C., Alden C.L. Kidney // Haschek and Rousseaux's handbook of toxicologic pathology. 2013. Third edition. P. 1667–1764.
2. Tharaux P.L., Huber T.B. How many ways can a podocyte die? // Seminars in nephrology. 2012. Vol. 32, № 4. P. 394–404.
3. Rabelinka T.J., Heerspinkb H.J.L., de Zeeuw D. Chapter 9. The pathophysiology of proteinuria // Chronic renal disease. 2015. P. 92–105.
4. Nagata M. Podocyte injury and its consequences // Kidney international. 2016. Vol. 89. P. 1221–1230.
5. Moeller M.J., Holzman L.B. Imaging podocyte dynamics // Nephron experimental nephrology. 2006. Vol. 103. P. 69–74.
6. Mathieson P.W. The podocyte as a target for therapies – new and old // Nature reviews. Nephrology. 2012. Vol. 8. P. 52–56.
7. Garg P. A review of podocyte biology // American journal of nephrology. 2018. Vol. 47 (1). P. 3–13.
8. Renal fibrosis: mechanisms and therapies / C.C. Lu [et al.] // Advances in experimental medicine and biology. 2019. Vol. 1165. P. 195–232.
9. Grahhamer F. New structural insights into podocyte biology // Cell tissue research. 2017. Vol. 369. P. 5–10.
10. Akilesh S. Glomerular disease // Patology of human disease. 2014. P. 2734-2752.
11. Nutritional impact of mycotoxins in food animal production and strategies for mitigation / R. Xu [et al.] // Journal of animal science and biotechnology. 2022. Vol. 13 (1). № 69. P. 19.
12. Analitika dannyh rasprostraneniya T-2 toksina v Respublike Tatarstan / I.N. Shtyrov [i dr.] // Mezhdunarodnyj vestnik veterinarii. 2021. № 1. S. 167–172.
13. Kozina E.A., Tabakov N.A. Ispol'zovanie adsor¬bentov v racionah myshej pri skarmlivanii zerna, soderzhaschego mikotoksiny // Vestnik KrasGAU. 2011. № 7 (58). S. 123–126.
14. Savkova M.G., Cyrenov S.O., Minina L.A. Ceolity Shivyrtujskogo mestorozhdeniya v predotvraschenii otricatel'nogo vozdejstviya mikotoksinov v racione kur-nesushek // Vest-nik KrasGAU. 2010. № 5 (44). S. 86–90.
15. `Eksperimental'nyj sochetannyj mikotoksikoz svinej na fone infekcionnoj nagruzki / `E.I. Semenov [i dr.] // Sel'skohozyajstvennaya biolo¬giya. 2022. T. 57, № 2. S. 371–383.
16. Perfilova K.V., Mishina N.N., Semenov `E.I. Obosnovanie komponentnogo sostava komp-leksnogo sredstva «Ceapitoks» v otnoshenii T-2 toksina v opytah in vitro // Uchenye zapiski Kazanskoj gosudarstvennoj akademii veteri¬narnoj mediciny im. N.`E. Baumana. 2021. T. 247, № 3. S. 208–212.
17. Izuchenie sorbcionnoj aktivnosti potencial'nyh sredstv profilaktiki mikotoksikozov v otnoshenii aflatoksinov / E.Yu. Tarasova [i dr.] // Veteri¬narnyj vrach. 2020. № 2. S. 51–58.
18. Nanotrubki galluazita – novoe `effektivnoe sredstvo dlya bor'by s mikotoksikozami / E.Yu. Tarasova [i dr.] // Nauchnaya zhizn'. 2020. T. 15, № 4 (104). S. 561–571.
19. Tarasova E.Yu. Izuchenie sorbcionnoj aktiv-nosti nanotrubok galluazita po otnosheniyu k zearalenonu i ohratoksinu A // Vestnik Marij-skogo gosudarstvennogo universiteta. Ser. «Sel'skohozyajstvennye nauki. `Ekonomiches-kie nauki». 2021. T. 7, № 1 (25). S. 64–70.
20. Ocenka ob`ektivnyh morfologicheskih priznakov mitohondrij gepatocitov krys pri sochetannom mikotoksikoze na fone primeneniya profilakti¬cheskih kompleksov / E.Yu. Tarasova [i dr.] // Vestnik KrasGAU. 2022. № 12 (189). S. 98–105.
21. Ocenka protektivnogo `effekta razrabotannyh profilakticheskih kompleksov na celostnost' DNK pri `eksperimental'nom sochetannom mikotoksikoze / E.Yu. Tarasova [i dr.] // Veteri¬narnyj vrach. 2022. № 4. S. 70–76.
22. Directive 2010/63/EU of the European Parliament and of the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes (Text with EEA relevance) // European Commission: Brussels, Belgium, 2010.
23. Metodicheskie rekomendacii po `elektronno-mikroskopicheskim issledovaniyam biologi-cheskih ob`ektov / A.V. Ivanov [i dr.]. M.: Rosinformagroteh, 2011. 67 s.
24. Transmissionnaya `elektronnaya mikroskopiya v biologii i medicine: monografiya / M.M. Sal'-nikova [i dr.]. Kazan': KFU, 2016. 125 s.
25. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis / J. Schindelin [et al.] // Nature methods. 2012. Vol. 9 (7). P. 676–682.
